Đệm casein hoạt động như thế nào

Page | 1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CNSH & KTMT
BÁO CÁO THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN
HỆ ĐẠI HỌC
GVHD: ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN
NHÓM: SÁNG THỨ 4
TỔ 4
DANH SÁCH NHÓM:
TP.Hồ Chí Minh, 4/2015
Page | 2
Mục lục
Page | 3
BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA
ENZYME
1.1. Nguyên tắc thí nghiệm
Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis
Km.Tốc độ phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có
trong môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hòa bởi nồng độ cơ chất thì tốc độ phản
ứng vẫn tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.
[1]
Do đó có thể khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thủy phân casein của Neutrase
bằng cách thay đổi nồng độ enzyme từ 2.4 đến 12 mM để tìm khoảng nồng độ
casein mà trong đó enzyme chưa bị bão hòa cơ chất.
[1]
Xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thủy phân của enzyme và nồng độ
cơ chất theo phương trình Lineweaver-Burk
[1]
Enyme neautrase: là một enzyme thuộc nhóm protease vi khuẩn được được sản
sinh bởi Bacillus amyloliquefaciens có thể phân giải protein, có thể dùng để
phân giải protein trong tách chiết DNA tế bào thực vật, động vật.pH tối

thích cho enzyme hoạt động trong khoảng từ 5.5-7.5, có thể bị bất hoạt ở
nhiệt độ 85
o
C trong 2 phút.
[2]
1.2. Tiến trình thí nghiệm
Bước 1. Pha hóa chất thí nghiệm.
 Pha dung dịch đệm phosphate:
[1]
− Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15 M :hòa tan 23.9 g Na
2
HPO
4
.12H
2
O trong nước vừa đủ
1000 ml.
− Dung dịch KH
2
PO
4
1/15 M : hòa tan 9.07 g KH
2
PO
4
trong nước vừa đủ 1000 ml.

Trộn 969 ml Na
2
HPO
4
1/15 M với 31 ml KH
2
PO
4
thu được 1000 ml dung dịch đệm
phosphate pH=8.
 Pha dung dịch đệm casein 12 mM:
Page | 4
Cân 2 g casein vào cốc pha, thêm khoảng 20-30 ml dung dịch NaOH 0.5, đặt lên
máy khuấy từ ở 50-60
o
C khuấy cho casein tan hết, vẫn tiếp tục để trên máy khuấy từ
tiếp tục khuấy nhưng không gia nhiệt nữa, dùng HCl có nồng độ tương ứng nhỏ vào
từ từ cho đến khi pH đạt 7.5 đến 8 (nhớ nhỏ HCl vào từ từ để tránh casein bị tủa và
pH tăng quá nhanh), dùng đệm phosphate pH=8 định mức đến 200 ml.
[1]
 Pha dung dịch chuẩn Tyrosine (1 mM):
Cân 181.19 mg Tyrosine hòa tan với HCl 0,2 N đủ 1 lít.
[1]
 Pha dung dịch Neutrase 0.5 %:
Cân 1.5 g neutrase thương mại hòa tan trong nước cất định mức 300 ml. Lọc dung
dịch qua giấy lọc, và thu nhận dịch lọc.
Bước 2. Lập đường chuẩn Tyrosin
Các bước lập đường chuẩn :
- Cho vào các ống nghiệm đánh dấu từ ống nghiệm 0 đến 5, bổ sung theo thứ tự từ 0
ml đến 1 ml Tyrosine , mỗi ống cách 0.2 ml (bảng 1.1).

- Cho vào các ống nghiệm HCl 0.2 N từ 5 ml giảm dần đến 4 ml, mỗi lần giảm 0.2
ml (bảng 1.1)
- Bổ sung vào mỗi ống 10 ml NaOH 0.5 N.
- Bổ sung vào mỗi ống 1 ml Folin pha loãng 3 lần.
- Lắc mạnh để yên trong 10 phút.
- Đo OD (Abs) ở bước sóng λ = 660 nm
Bảng 1.1. Bảng tóm tắt quy trình lập đường chuẩn Tyrosin
[1]
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dd Tyrosine
chuẩn (ml)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Tyrosine tương
ứng
0.2 0.6 0.4 0.6 0.8 1
HCl 0.2 N (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4
NaOH 0.5 N 10
Folin pha loãng 3
lần
1
Lắc mạnh, để yên trong 10 phút.
Đo OD (Abs) ở
bước sóng λ =
660 nm
0 ? ? ? ? ?
Page | 5
Bước 3. Xác định các thông số động học của enzyme Neurase
Các bước tiến hành :
- Các ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5.
- Cho dung dịch casein 12 mM vào theo thứ tự ống 0 đến 5 từ 0 đến 5 ml, mỗi ống

cách nhau 1 ml.(Bảng 1.2)
- Cho vào mỗi ống dung dịch phosphate đã pha ở bước 1, theo thứ tự ống 0 đến 5,
từ 5 giảm xuống 0 ml, mỗi ống cách nhau 1 ml.(Bảng 1.2)
- Cho vào ống nghiệm dung dịch enzyme Neutrase (chuẩn bị ở bước 1) cho vào mỗi
ống nghiệm 5 ml.
- Để yên ở 50-55
o
C trong 2 phút.
- Bổ sung vào mỗi ống nghiệm 5 ml dung dịch TCA 5%.
- Để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới.
- Hút 5 ml dịch lọc ở mỗi ống nghiệm cho vào các ống nghiệm khác.
- Cho vào mỗi ống nghiệm 10 ml NaOH 0.5 N
- Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml Folin pha loãng 3 lần.
- Lắc mạnh (vortex nhanh), sau đó để yên 10 phút.
- Đo OD (Abs) ở bước sóng λ = 660 nm.
Bảng 1.2. Bảng tóm tắt quy trình xác định thông số động học enzyme Neurase.
[1]
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Casein 12 mM 0 1 2 3 4 5
Casein tương
ứng (mM)
0 2.4
Đệm phosphate
(ml)
5 4 3 2 1 0
Neurase 0.5% 5
Để yên trong 50-55
o
C trong 2 phút
TCA 5 % (ml) 5

Để yên trong 15 phút lọc lấy dịch bên dưới
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dịch lọc 5
NaOH 0.5 (ml) 10
Folin pha loãng
3 lần (ml)
1
Lắc mạnh để yên trong 10 phút
Đo OD (Abs) tại
λ =660 nm
0 ? ? ? ? ?
Page | 6
1.3. Giải thích thí nghiệm.
- Có thể lý giải tại sao phải khảo sát hàm lượng Tyrosine bài này, là vì để xác định
tốc độ phản ứng của enzyme với cơ chất, ta có thể dựa vào sự biến thiên nồng độ
cơ chất hay nồng độ sản phẩm tạo thành, và trong bài này chọn phương pháp xác
định biến thiên nồng độ sản phẩm tạo thành thông qua xác định hàm lượng sản
phẩm Tyrosine. Tyrosine tạo ra qua quá trình tiếp xúc giữa protein casein và
Neutrase, Neutrase phân cắt casein tạo thành các amino acid trong đó có Tyrosine.
- Việc bổ sung TCA 5 % trong thí nghiệm như chất trợ tủa casein, tạo pH đẳng điện,
giúp cho việc xác định Tyrosine thông qua quá trình đo OD được dễ dàng.
- Folin là chất tạo màu với Tyrosine để xác định hàm lượng Tyrosine dựa vào độ
màu, với bước sóng thích hợp cho phức hợp màu là 660 nm.
1.4. Kết quả thí nghiệm
1.4.1. Số liệu và xử lý số liệu
- Kết quả đo OD lập đường chuẩn Tyrosine
Bảng 1.3. Kết quả đo OD đường chuẩn
Ống nghiệm
(n)
0 1 2 3 4 5

OD 0.013 0.039 0.056 0.075 0.102 0.107
Lượng Tyrosin
chuẩn (µmol)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
∆OD 0 0.026 0.043 0.062 0.089 0.097
Với giá trị ∆OD được tính như sau ∆ OD
n
= OD
n
-OD
o
, với OD
o
là giá trị OD đo
được ở ống 0.
Với giá trị y là ∆OD và x là lượng Tyrosine chuẩn ta được biểu đồ đường chuẩn
biểu diễn ∆OD theo lượng Tyrosine như sau :y = 0.099x +0.0033; R
2
=0.987
Page | 7
- Kết quả đo OD xác định các thông số động học của enzyme Neurase.
Thay giá trị ∆OD (y) do được ở mỗi ống vào phương trình chuẩn y =0.099x +0.0033
ta xác định được lượng Tyrosin tương ứng (x), được ghi nhận trong bảng sau:
Bảng 1.4.Giá trị OD và hàm lượng tyrosine tạo thành.
Ống nghiệm
(n)
0 1 2 3 4 5
OD 0.203 0.304 0.420 0.521 0.553 0.586
∆OD(y) 0 0.101 0.217 0.318 0.350 0.383
Lượng

Tyrosine
tương ứng
trong 5 ml
(µmol)
0 0.98687 2.15859 3.17879 3.50202 3.83535
Lượng
Tyrosine trong
15 ml dung
dịch ban đầu
(µmol)
0 4.93434
10.7929
3
15.8939
4
17.5101
0
19.1767
7
Tuy nhiên do chỉ lấy ra 5 ml từ dịch lọc nên [lượng Tyrosin trong dung dịch ban đầu
(trong 15 ml dung dịch) = [lượng Tyrosin trong 5 ml dịch lọc] x3
Tính vận tốc phản ứng (V)=d(P)/dt =Lượng Tyrosine/thời gian.
Kết quả tính được ghi nhận trong bảng 1.5 với thời gian phản ứng t=2 phút=120s
Bảng 1.5. Bảng số liệu xác định thông số động học K
m
, V
max
.
Ống nghiệm
1 2 3 4 5

Page | 8
Hình 1.1.Hỗn hợp dung dịch enzyme, casein, đệm và TCA trước khi lọc.(Xác định thông số động học)Hình 1.2.Các ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch lọc bổ sung đã bổ sung Folin (xác định thông số)
Lượng Casein
(S) mM trong
2.4 4.8 7.2 9.6 12
1/S
0.41667 0.20833 0.13889 0.10417 0.083333
V(mM/s)
0.04112 0.08994 0.13245 0.14592 0.15981
1/V
24.31934 11.11839 7.55005 6.85319 6.25757
Theo phương trình Lineweaver-Burk

Đặt b = , a = ; x = ;y = ta có phương trình y =ax+b
Sử dụng phần mềm Excel ta được phương trình biểu diễn 1/S theo 1/V :
y=55.549x + 0.6499, với R
2
=0.9856 (biểu đồ 1.2), do đó :
a = = 55.549 (1);
b = = 0.6499 (2);
Giải hệ phương trình (1), và (2) ta được K
M
= 85.473 mM ;V
max
=1.539 (mMsec
-1
)
1.4.2. Kết quả hình ảnh
Page | 9
1.5. Kết luận và kiến nghị

 Qua bài thí nghiệm, chúng tôi có một số kết luận như sau:
- Phương trình đường chuẩn Tyrosine xác định: y = 0.099x +0.0033; R
2
=0.987
- Phương trình thể hiện mỗi quan hệ 1/V theo 1/S là: y=55.549x + 0.6499, với R
2

=0.9856
Thông số động học enzyme: K
M
= 85.473 mM ;V
max
=1.539 (mMsec
-1
)
- Mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng là mối quan hệ tuyến tính,
theo biểu đồ 1.2, có thể thấy đường biểu diễn gần như là một đường thẳng, với R
2

thì phương trình đường thẳng này sát với đường biểu diễn, phương trình đường
thẳng là phương trình bậc 1 sẽ càng chính xác.
- Thực nghiệm và lý thuyết cho kết quả giống nhau là khi enzyme chưa bị bão hòa
bởi nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.
- Tuy nhiên vẫn còn sai số có thể lý giải là do:
+ Thao tác đo OD chưa chuẩn xác, tráng mẫu chưa thật tốt.
+ Quá trình lọc rửa chưa tốt.
Tuy nhiên với hệ số R
2
đều gần như 99 % nên, có thể chấp nhận sai số trên.Kết
quả thí nghiệm tốt.