Phân lập vi sinh vật (VSV) là một quá trình tách rời một loại VSV nào đó từ quần thể VSV, sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc
Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp các VSV sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy truyền vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể mới. Quần thể VSV trong ống nghiệm này được gọi là một chủng VSV hoặc là ống giống.
Chủng VSV thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng VSV được thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng VSV thuần khiết.
Nấm men (Yeasts), là những VSV có cấu tạo đơn bào, nhân có màng nhân, sinh sản chủ yếu theo hình thức nẩy chồi. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau, có thể hình cầu, hình bầu dục, hình elip, hình ống... Kích thước tế bào thay đổi từ 1,5-12µm (micromet). Nếu tế bào dạng sợi thì chiều dài có thể tới 20µm hay hơn nữa, thường là sợi nấm giả gồm nhiều tế bào dính lại với nhau theo chiều dài hoặc dạng cành cây một cách lỏng lẻo. Nấm men có mặt khắp mọi nơi, chúng phân bố nhiều trong đất vườn, trong bánh men rượu, trên bề mặt vỏ quả cũng như các dịch quả ép dứa, lê, táo, nho, mơ...
Phân lập nấm men
* Môi trường Hansen:
- Đường glucose 50g;
- KH2PO4 3g;
- MgSO4.7H2O 3g;
- Peptone 10g;
- Thạch (agar-agar) 20g;
- Chỉnh pH=6,0;
Khử trùng 121 độ C, 1atm/15 phút.
* Hoặc môi trường mạch nha có thành phần:
- Mạch nha 150g,
- Thạch 20g;
- Chỉnh pH=7,0;
Khử trùng 121 độ C, 1atm/15 phút.
* Các bước tiến hành
1. Chuẩn bị môi trường Hansen (hoặc mạch nha) thạch đĩa, thạch nghiêng. Các đĩa môi trường có chứa 0,03g/l streptomycin hay rosebengal (1/3.000) 100ml/l.
2. Thu mẫu, xử lý mẫu và pha loãng
- Thu mẫu: bánh men rượu, hoặc quả chín nho, táo, mơ, mận...
- Cân 1-2g mẫu trên thêm 1-2g đường saccharose, 2ml nước cất, trộn đều ủ 3-5 ngày.
- Lấy 1ml dịch huyền phù ở trên pha loãng từ 10-1 đến 10-10 lần.
3. Phân lập nấm men rượu
- Cách 1: cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc trong hộp Petri.
+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên bề mặt của môi trường trong hộp Petri.
+ Dùng que trang dàn đều giọt dịch huyền phù trên toàn bộ bề mặt môi trường hộp thạch.
+ Đậy hộp Petri, gói lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28-30 độ C (nhiệt độ phòng) trong 48-72h.
- Cách 2: trộn dịch mẫu pha loãng trong các môi trường thạch nóng chảy.
+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định vào đĩa petri có chứa môi trường thạch để nguội đến 45-500C, lắc đều.
+ Chờ cho môi trường có chứa huyền phù cô đặc lại. Gói các hộp Petri và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28-30 độ C trong 48-72h.
Sau thời gian trên ở bề mặt đĩa thạch sẽ có các khuẩn lạc nấm men mọc tách biệt, mắt thường quan sát được.
4. Thu nhận chủng nấm men rượu thuần khiết
- Cấy nấm men từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng.
- Nuôi nấm men ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (như trên).
- Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống có các chủng thuần khiết.
Có nhiều cách kiểm tra:
+ Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc: màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng mẫu.
+ Quan sát nấm men: làm tiêu bản từ dịch lên men, nhuộm đơn bằng xanhmethylen, rồi quan sát với vật kính x100 (vật kính dùng dầu). Tế bào nấm men có hình cầu hay ôvan, có một số đang ở giai đoạn nảy chồi.
Lemco’ powder, Yeast extract và Peptone, ngoài ra môi trường còn bổ sung thêm đường glucose và lactose để phân biệt các loài thuộc họ vi khuẩn đường ruột. Quá trình lên men đường glucose và lactose tạo axit làm thay đổi màu của chỉ thị pH phenol đỏ. Ferric citrate và sodium thiosulphit dùng để phát hiện sự sản sinh khí H2S, tạo khuẩn lạc màu đen ở đáy.
Các vi khuẩn không lên men lactose đầu tiên sẽ sinh một lượng nhỏ axit làm đổi màu sắc mặt nghiêng từ đỏ sang vàng bởi quá trình lên men glucose. Khi lượng glucose bị cạn kiệt, vi sinh vật tiếp tục oxi hóa các axit amin trong phần nghiêng của ống nơi có oxy và mặt nghiêng trở lại pH kiềm chuyển sang màu đỏ, và hiện tượng này không xảy ra ở điều kiện kị khí ở phần đáy ống môi trường.
Môi trường nuôi cấy là môi trường được sử dụng trong phòng thí nghiệm để cung cấp các chất dinh dưỡng và khoáng chất cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Các vi sinh vật khác nhau có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau nên cần sử dụng các loại môi trường nuôi cấy khác nhau. Nuôi cấy vi sinh vật rất quan trọng cho nhiều mục đích khác nhau như chẩn đoán bệnh, nghiên cứu đặc điểm di truyền và xác định các loài vi sinh vật. Nó cũng được sử dụng để thử nghiệm các chất chống vi trùng, nghiên cứu các phản ứng sinh hóa và kiểm tra ô nhiễm vi khuẩn. Bài viết này tập trung vào việc phân loại và các loại môi trường nuôi cấy được sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh.
Môi trường nuôi cấy được xây dựng đặc biệt để thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật, đồng thời giảm thiểu sự tích tụ của bất kỳ sản phẩm phụ không mong muốn nào. Các yêu cầu cụ thể đối với các môi trường này chủ yếu xoay quanh loại vi sinh vật được sử dụng trong quy trình lên men. Tuy nhiên, những nhu cầu cơ bản cho các sinh vật này vẫn nhất quán, bao gồm việc cung cấp năng lượng, nước, carbon, nitơ, vitamin và khoáng chất.
Hình 1. Môi trường thạch nấm men
Phân loại
Môi trường nuôi cấy có thể được phân loại theo hình thức vật lý, thành phần dinh dưỡng và mục đích sử dụng.
Dựa trên tính nhất quán của chúng:
- Môi trường đặc: Chứa agar hoặc các chất đông đặc khác, cho phép vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc.
- Môi trường bán đặc: Chứa nồng độ agar thấp hơn, dẫn đến độ đặc giống như thạch. Được sử dụng để nghiên cứu khả năng di chuyển của vi khuẩn.
- Môi trường dịch thể: Không chứa chất đông đặc, giúp vi khuẩn phát triển đồng đều. Được sử dụng cho các nghiên cứu tăng trưởng và lên men rộng rãi.
Dựa trên thành phần dinh dưỡng của chúng:
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: Chứa các chất dinh dưỡng cơ bản thích hợp cho vi sinh vật không khó tính.
- Môi trường nuôi cấy phức tạp: Chứa nhiều chất dinh dưỡng với số lượng chưa xác định để hỗ trợ sự phát triển của các vi sinh vật cụ thể.
- Môi trường nuôi cấy tổng hợp: Chứa nồng độ xác định của các chất hóa học tinh khiết, được sử dụng cho nghiên cứu khoa học.
Dựa trên ứng dụng và thành phần hóa học của chúng:
- Môi trường nuôi cấy cơ bản: môi trường đơn giản được sử dụng để phát triển nhiều loại vi sinh vật.
- Môi trường nuôi cấy tăng sinh: môi trường cơ bản đã được bổ sung thêm chất dinh dưỡng để hỗ trợ sự phát triển của vi sinh vật khó tính.
- Môi trường nuôi cấy chọn lọc: môi trường thạch được sử dụng để phân lập các vi sinh vật cụ thể bằng cách ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác.
- Môi trường tăng sinh: nước canh lỏng kích thích sự phát triển của các vi sinh vật cụ thể đồng thời ức chế sự phát triển của các loài hội sinh, thường được sử dụng để phân lập mầm bệnh từ mẫu phân và đất, chẳng hạn như nước canh selenite F cho Salmonella typhi, nước canh tetrathionate và nước pepton kiềm.
- Môi trường nuôi giám biệt: Thuốc nhuộm hoặc chất nền trao đổi chất trong các môi trường này tạo ra các màu khuẩn lạc riêng biệt cho các vi sinh vật khác nhau tùy thuộc vào hoạt động trao đổi chất của chúng, ví dụ như màu đỏ trung tính, đỏ phenol và xanh methylene.
- Môi trường kỵ khí: Được thiết kế để nuôi dưỡng vi khuẩn nhạy cảm với oxy và được làm giàu bằng hemin và vitamin K, trong khi oxy được loại bỏ bằng cách đun sôi và niêm phong bằng parafin, chẳng hạn như trong môi trường thioglycollate và môi trường Thịt nấu chín Robertson (RCM), thường được sử dụng để nuôi cấy Clostridium spp.
- Môi trường phân tích: Được sử dụng để đánh giá độ nhạy cảm với axit amin, vitamin và kháng sinh. Ví dụ, môi trường xét nghiệm kháng sinh đo lường hiệu lực kháng sinh của vi sinh vật.
- Môi trường nuôi cấy lưu trữ: Được sử dụng để bảo quản vi sinh vật trong thời gian dài, chẳng hạn như nước luộc thịt nấu bằng phấn và môi trường muối trứng.
Phần kết luận
Hình 2. Hệ thống sản xuất môi trường nuôi cấy tại nhà máy
Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp là điều cần thiết cho sự phát triển và nghiên cứu thành công của vi sinh vật trong môi trường phòng thí nghiệm. Do nhu cầu dinh dưỡng đa dạng của các vi sinh vật khác nhau nên việc xây dựng một công thức môi trường nuôi cấy duy nhất không thể áp dụng phổ biến. Các nhà khoa học đã phát triển nhiều loại môi trường nuôi cấy được phân loại dựa trên thành phần dinh dưỡng, độ đặc và mục đích sử dụng của chúng. Các môi trường này phục vụ các mục đích quan trọng trong vi sinh học, bao gồm phân lập các chủng cụ thể, xác định mầm bệnh, chuẩn bị môi trường nuôi cấy thuần khiết, phân biệt các loài vi khuẩn và đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh. Vì vậy, việc xem xét cẩn thận mục đích nghiên cứu và đặc điểm của vi sinh vật mục tiêu là điều quan trọng khi lựa chọn môi trường nuôi cấy, đảm bảo thí nghiệm hiệu quả và hiệu quả.