ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TIỂU LUẬN HỌC PHẦNCÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬTTÊN TIỂU LUẬN:CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ Ở TẾ BÀO THỰC VẬTTHÁI NGUYÊN - 2014MỤC LỤCI. MỞ ĐẦU1.1. Đặt vấn đềTừ xa xưa, con người đã biết nhân giống cây trồng bằng rất nhiều biệnpháp. Từ cách gieo hạt đến cách mà người ta lấy trực tiếp một nhánh cây đểtrồng, gọi là giâm cành, chiết cành… hay ghép những thân cây này với thân câykia bằng cách ghép cành. Do đó, cùng một lúc chúng ta có thể nhân lên hàngloạt cây trồng mà không mất nhiều thời gian để gieo hạt, chờ cho cây con lớn.Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hiện đại, công nghệ nuôi cấy mô tếbào ra đời, công nghệ này giúp tạo ra hàng loạt cây trồng mới một cách nhanhchóng mà không nhất thiết là từ các hạt của cây mà có thể lấy từ bất kỳ mô bàonào của cây, trừ những mô bào đã hóa gỗ.Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật là một trong những công nghệquan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụngcác công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trong nhữngnăm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lạihiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Nhữngthành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nôngnghiệp công nghệ cao mang tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế.21. 2. Mục tiêu nghiên cứu- Hiểu rõ khái niệm và các căn cứ khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào ởthực vật.- Quy trình nuôi cấy mô tế bào ở thực vật.- Các vấn đề tồn tại trong nuôi cấy mô tế bào ở thực vật và công nghệ mới trongnuôi cấy mô tế bào.3II. NỘI DUNG2.1. Căn cứ khoa hoc2.1.1. Khái niệmNuôi cấy mô ở tế bào thực vật là một phạm trù khái niệm chung cho tất cảcác loại nuôi cấy mà nguyên liệu là thực vật hoàn toàn sạch bệnh trên môitrường nhân tạo trong điều kiện vô trùng.Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trongống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiênngoài ống nghiệm, gọi là nuôi cấy in vivo.Nuôi cấy mô ở tế bào thực vật bao gồm:- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.- Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…- Nuôi cấy phôi non và phôi trưởng thành.- Nuôi cấy mô sẹo.- Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần).- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).Hiện nay trên thế giới kĩ thuật nuôi cấy mô đặc biệt kĩ thuật nuôi cấy mô tếbào được áp dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới nhất là trong cây trồng vàvật nuôi, nhằm tăng năng suất trong trồng trọt và chăn nuôi đáp ứng được nhucầu lương thực, thực phẩm cho xã hội loài người ngày nay.2.1.2. Căn cứ khoa học* Tính toàn năng của tế bào thực vậtLần đầu tiên Haberlandt (1992) đã quan niệm rằng mỗi tế bào bất kì củamột cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cáthể hoàn chỉnh và sau này đó chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấymô tế bào thực vật.Ngày nay đã chứng minh được tính toàn năng của tế bào. Tính toàn năngtheo quan điểm sinh học hiện đại chính là mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể sinh vật đó. Khi4gặp điều kiện thuận lợi mỗi tế bào đều có khả năng phát triển tạo thành một cơthể mới hoàn chỉnh.* Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào- Sự phân hóa tế bào: là sự chuyển các tế bào phôi sinh ban đầu hìnhthành các tế bào mô chuyên hóa đảm nhận các chức năng khác nhau. Ví dụ: môdậu ở lá làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ…Sơ đồ: các giai đoạn phân hóa của tế bàoTế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa (có chức năng riêng biệt).- Sự phản phân hóa tế bào: Khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chứcnăng chuyên hóa chúng vẫn không hoàn toàn mất khả năng biến đổi củamình. Trong những điều kiện nhất định cần thiết nếu chúng gặp điều kiệnthích hợp lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ.Quá trình này gọi là sự phân hóa tế bào nó ngược lại với quá trình phânhóa tế bào.- Sơ đồ: Mối quan hệ giữa quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bàoVí dụ: khi nuôi cấy mô thuốc lá tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiệnthuận lợi của môi trường sẽ phân hóa và tiếp tục phân chia liên tục tạo thành cácmô sẹo. Các mô sẹo không còn là tế bào có chức năng như tế bào lá nữa. Nếuchuyển các mô sẹo sang các môi trường khác nhau tùy theo thành phần môitrường mà tế bào mô sẹo có thể phân hóa theo hướng hình thành chồi, rễ, và cóthể tạo thành cây hoàn chỉnh.Như vậy, quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vậtthực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào. Vậy kĩ5thuật nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chính là kĩ thuật điều khiển sự phát sinhhình thái của tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phảnphân hóa tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào.Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy người ta thường bổsung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật làauxin và xitokinin. Tỷ lệ của hai nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sựphát sinh hình thái khác nhau.2.2. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật2.2.1. Khả năng nuôi cấy của các loại mô và tế bàoVề nguyên tắc, mọi loại tế bào của một cơ thể thực vật đều giữ được tínhtoàn năng có nghĩa là khả năng nuôi cấy thành công. Tuy nhiên trong thực tiễncác loại tế bào và các loại mô khác nhau thì có biểu hiện rất khác nhau về triểnvọng nuôi cấy thành công. Một nguyên tắc cơ bản được tổng kết là càng gầntrạng tái tế bào phôi bao nhiêu thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao bấynhiêu. Như vậy, tế bào và mô của phôi non là triển vọng nhất, sau đó là đến cáctế bào đỉnh sinh trưởng ở trạng thái hoạt động (như chồi ngọn, đầu rễ …) hay ởtrạng thái ngủ nghỉ (như phôi mầm, chồi nách …). Cũng rất gần với phôi là cáctế bào sinh dục như noãn bào, tế bào hạt phấn ở giai đoạn non…2.2.2. Nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô* Các bước chính trong nhân giống in vitroTheo Georger (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm cácbước sau:Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ (các cây cho mẫu nuôi cấy)- Sạch bệnh đặc biệt là các bệnh virus trong giai đoạn sinh trưởng mạnh.- Các cây mẹ trồng trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chămsóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu để cấy. Bước 2: Nuôi cấy khởi động: là giai đoạn khử trùng mẫu đưa vào nuôicấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ6sống sót cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Chú ý khi lấy mẫu cần chọn đúngloại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây thì sẽ đạt hiệu quả cao.Bước 3: Nhân nhanh: là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hìnhthái và tăng số lượng thông qua các con đường như hoạt hóa chồi nách, tạo chồibất định và tạo phôi vô tính. Trong bước này phải cần chú ý đến môi trườngnuôi cấy và các điều kiện ngoại cảnh để có hiệu quả cao nhất.Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnhĐể tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sangmôi trường tạo rễ.Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiênĐể đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao cây sinh trưởngmạnh cần đảm bảo một số yêu cầu sau:- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định.- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp thoátnước…- Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũngnhư có chế độ dinh dưỡng phù hợp.* Ý nghĩaĐây là lĩnh vực mang lại hiệu quả kinh tế cao. Một trong những ưu việtcủa phương pháp này là việc sử dụng các mô nuôi cấy có kích thước nhỏ. Ở kíchthước nhỏ, sự tương tác giữa các tế bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Mô nuôi cấysẽ dễ phân hóa và sau đó dễ tái sinh hơn.Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt hơn mà các phương phápkhác không có được như: có thể sản xuất cây giống trên quy mô công nghiệp, cóhệ số nhân giống cao và tạo ra các cá thể có hệ gen hoàn toàn đồng nhất. Kỹthuật nhân nhanh được ứng dụng vào những mục đích sau:- Duy trì và nhân nhanh các keieru gen quý làm vật liệu cho công tác chọntạo giống.- Nhân nhanh các loài cây cảnh, loài hoa khó trồng bằng hạt.7- Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.- bảo quản tập đoàn gen.Với phương pháp này hiện nay người ta đã tạo ra được nhiều giống cây nôngnghiệp có năng suất cao tạo được các loài cây cảnh, cây lâm nghiệp được phổbiến nhanh vào trong sản xuất.2.3. Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào2.3.1. Tính bất định về mặt di truyền (genetic instability)Mục đích của nhân giống in vitro là tạo ra quần thể cây đồng nhất với sốlượng rất lớn. Tuy nhiên, trong một số trường hợp phương pháp này cũng tạo ranhững biến dị soma. Tần số biến dị cũng hoàn toàn khác nhau và không lặp lại.Cây tạo ra do nuôi cấy tế bào mô sẹo có nhiều biến dị hơn so với nuôi cấy chồiđỉnh.Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:- Kiểu di truyền: tần số biến dị ảnh hưởng bởi genotyp của các loài câytrồng khác nhau. Nói chung cây càng có mức bội thể cao thì càng dễ biếndị.- Số lần cấy chuyển càng nhiều thì độ biến dị càng cao. Theo Amstrong vàPhilips (1998): khi nuôi cấy lâu dài thường gây ra biến dị nhiễm sắc thể.- Loại mô: nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh in vitro ítbị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ quan khác.2.3.2. Sự nhiễm mẫu đấtCác vi sinh vật như nấm, vi khuẩn nói chung đều bị loại trừ khi khử trùngmẫu đưa vào nuôi cấy. Tuy nhiên, một số loại vi khuẩn như: Agrobacterium,Bacills, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào môdẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2tuần nuôi cấy). Để khắc phục được hiện tượng trên trước hết cần lựa chọn câymẹ đúng tiêu chuẩn. Có thể sử dụng một số chất kháng sinh để chống hiện tượngnhiễm khuẩn và nấm. Nhưng mô thực vật rất mẫn cảm với kháng sinh và phảnứng đến kiểu di truyền do đó cần rất thận trọng khi sử dụng kháng sinh. Chất8kháng sinh thường gây ra những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởngđến di truyền tế bào chất. 2.3.3. Sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấyTrong nuôi cấy mô thường quan sát thấy hiện tượng hóa nâu hay đen mẫu,mẫu này có thể khuếch tán trong môi trường. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấycó chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol. Thí dụ các chất phenoleucomicacid và tyramine đã làm hóa nâu mẫu cây lan Cattleya khi nuôi cấy. Cácphương pháp trừ sự hóa nâu:- Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuô cấy (0,1-0,3%), phương phápnày đặc biệt có hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis, Cattleya vàAerides. Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanhcây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiếtkhác.- Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫumột số cây ăn quả (táo, hồng).- Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng.- Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.- Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng, oxi thấp, không có ánh sáng (1-2tuần).- Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1-2tuần.2.3.4. Hiện tượng thủy tinh hóaCây bị “thủy tinh hóa” – thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khósống khi đưa ra ngoài môi trường do bị mất nước rất mạnh. Thường xảy ra khinuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp. Đặcbiệt thường xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền và hoacúc. Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo cónhiều phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nước. Cây in vitro thường có mật độ khíkhổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong9quá trình nuôi cấy. Để tránh hiện tượng thủy tinh hóa có thể tiến hành một sốgiải pháp:- Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ chất đường hoặc cácchất gây áp suất thẩm thấu cao.- Giảm nồng độ các chất chứa nito trong môi trường.- Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.- Sử lý axit adsixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng2.4. Những công nghệ mới trong nuôi cấy mô tế bào thực vật2.4.1. Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡngLà bước phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo sư T.KoyokiKozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua. Công trình nghiên cứu tậpchung vào vấn đề nhân giống cây nuôi cấy mô trên môi trường không có đườngnhưng được điều khiển chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2. Công nghệnày đã được thử nghiệm thành công trên nhiều đối tượng cây trồng như cà chua,khoai lang, rau spinach, dưa chuột, xà lách, keo, cà phê, xoài, tre, thông… Côngnghệ này đang được tiếp tục hoàn thiện để làm cơ sở cho hệ thống nhân giốngcông nghiệp hóa. Lợi ích của công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng:- Tốc độ sinh trưởng, chất lượng và tỷ lệ sống của mô thực vật được nângcao ở tất cả các bước trong nhân giống trong điều kiện tự dưỡng.- Thiệt hại do sự nhiễm mẫu được hạn chế do không sử dụng đường trongmôi trường.- Tỷ lệ đột biến có thể được giảm vì cây được nuôi trong điều kiện môitrường giống tự nhiên.- Tự động hóa và do đó giảm được chi phí lao động.Nhược điểm:- Chi phí cao cho việc điều khiển môi trường (ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2).- Cây vấn sinh trưởng trong điều kiện vô trùng vì vậy dẫn đến chi phí caocho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá thể.102.4.2. Bioreactor* Sự phát triển công nghệ Bioractor trong vi nhân giống cây trồngTakayama và Miasawa là những người đầu tiên nghiên cứu sử dụngbioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoaly, hoa lan hồ điệp, cỏ ngọt với công suất 20000 chồi/bình bioreator 500lit….Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiếtbị bioreator hoàn toàn tự động hóa. Ví dụ: một bioreactor inbro – mier (rung vàtrộn) trang bị với các ống silicone sục khí tự do đã có khả năng sản xuất 100000phôi vô tính của cây trạng nguyên trong một lít dung dịch huyền phù nếu nhưdung dịch đó được đặt trên một tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần.Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hànhrất phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.* Thuận lợi của hệ thống bioreactor so với môi trường nuôi cấy trong bình- Thể tích nuôi cấy tăng, thường là ít nhất 1 lít. Điều này cho phép sảnxuất nhiều phôi, chồi hơn mà không cần những kỹ thuật cao cấp- Hầu hết các bình bioreator được thiết kế với một cơ chế khuấy, bằng cơhọc hay bằng thổi khí, để duy trì nuôi cấy gần như đồng dạng.- Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy và môi trường vật lýcó thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng. Có những chỉ dẫn về các nhântố môi trường như pH và oxygen hòa tan. Điều này không thể thực hiện đượcvới hệ thống nuôi cấy bình tam giác.* Cách nhân giống bằng bioreactorBioreator có thể được ứng dụng để vi nhân giống thực vật trên quy môthương mại theo 3 hướng:(1) Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan…)(2) Tạo củ in vitro (khoai tây, lily…)(3) Tạo phôi soma (cà phê, cao su,…)11III KẾT LUẬNCông nghệ nuôi cấy mô tế bào hiện nay đang rất phổ biến và là ngành cótiềm năng phát triển mạnh. Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật này đã làmnên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người tađang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thươngmại. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương phápnhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây côngnghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây dược liệu, cây ăn trái và rau xanh. Nhữngkiến thức về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cốvà có nhiều bước tiến rõ rệt. Với phương pháp này người ta có thể nhân giốngrất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phươngpháp nhân giống truyền thống không thể thực hiện được.Ngoài ra, không chỉ riêng lĩnh vực cây trồng, công nghệ nuôi cấy này còncó ở động vật và cả con người. Tuy nhiên, công nghệ này đòi hỏi chi phí bảoquản cao, thiết bị máy móc hiện đại đắt tiền và đội ngũ cán bộ lành nghề nên cầnđược đầu tư hơn nữa mới đem lại hiệu quả cao.12TÀI LIỆU THAM KHẢO1. Lê Văn Hoàng, 2008. Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, NXB Đại học Đà Nẵng.2 Nguyễn Hoàng Lộc (chủ biên), 2011. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật – các khái niệm và ứng dụng, NXB Đại học Huế.3. Nguyễn Đức Thành, 2000. Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội.13 |
