Mức dịch ý nghĩa của PHƯƠNG pháp sắc ký lớp mỏng định tính dược liệu hòe hóa

HOÈ (Nụ hoa)

Flos Styphnolobii japonici imaturi

Nụ hoa đã phơi hay sấy nhẹ đến khô của cây Hoè (Styphnolobium japonicum (L.) Schott, Syn. Sophora japonica L.), họ Đậu (Fabaceae).

Mô tả

Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 3 - 6 mm, rộng 1 - 2 mm, màu vàng xám.  Đài hoa hình chuông, màu vàng xám, dài bằng 1/2 đến 2/3 chiều dài của nụ hoa, phía trên xẻ thành 5 răng nông. Hoa chưa nở dài từ 4 - 10 mm, đường kính 2 - 4 mm. Cánh hoa chưa nở màu vàng. Mùi thơm, vị hơi đắng.

Bột

Có nhiều hạt phấn hình cầu, đường kính 16 mm, có 3 lỗ rãnh, bề mặt có nếp nhăn dạng mắt lưới. Lông che chở đa bào gồm 2 - 4 tế bào, tế bào ở phía đầu dài và thuôn nhọn, tế bào ở chân ngắn. Mảnh biểu bì cánh hoa gồm những tế bào hình nhiều cạnh có nhiều vân nhỏ, xít nhau. Mảnh biểu bì đài hoa gồm những tế bào hình nhiều cạnh có mang lỗ khí (kiểu thập tự) và lông che chở. Mảnh mạch xoắn.

Định tính

A. Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol (TT). Đun sôi trong 3 phút, để nguội, lọc. Dịch lọc (dung dịch A) dùng làm các phản ứng sau và dịch chấm sắc ký lớp mỏng.

B. Lấy 2 ml dung dịch A pha loãng với 10 ml ethanol 90% (TT) rồi chia vào 3 ống nghiệm:

Ống 1: Thêm 5 giọt acid hydrocloric (TT) và ít bột magnesi (TT), dung dịch chuyển dần từ màu vàng nhạt sang màu hồng rồi tím đỏ.

Ống 2: Thêm 2 giọt dung dịch natri hydroxyd 20% (TT), xuất hiện tủa vàng cam, tủa sẽ tan trong lượng dư thuốc thử.

Ống 3: Thêm 2 giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT), dung dịch có màu xanh rêu.

C. Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch A lên tờ giấy lọc, để khô, soi dưới đèn tử ngoại (ở bước sóng 366 nm) sẽ quan sát thấy huỳnh quang màu vàng nâu.

D. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4).

Bản mỏng: Silica gel GF254

Dung môi khai triển: n- butanol- acid acetic- nước (4: 1: 5).

Dung dịch thử: Dung dịch A

Dung dịch chuẩn: Hoà tan rutin trong ethanol 90% (TT) để được dung dịch có chứa 1 mg/ml.

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 ml mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai xong, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 366 nm, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng phát quang màu nâu và cùng giá trị Rf với vết rutin trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu. Hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc (TT), trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng có cùng giá trị Rf với vết rutin chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.

Độ ẩm

Không quá 12 % (Phụ lục 12.13).

Tro toàn phần

Không quá 10% (Phụ lục 9.8).

Tạp chất (Phụ lục 12.11)

Tỷ lệ hoa đã nở: Không quá 10%

Tỷ lệ hoa sẫm màu:  Không quá 1%

Các bộ phận khác của cây: Không quá 2% .

Định lượng

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô (trong chân không) tới khối lượng không đổi, cho vào một bình định mức 100 ml. Hoà tan trong 70 ml methanol (TT) bằng cách làm ấm trên cách thuỷ. Để nguội, thêm methanol (TT) đủ 100 ml, lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch này cho vào một bình định mức 100 ml khác. Thêm nước tới vạch, lắc kỹ (mỗi ml chứa 0,2 mg rutin khan).

Xây dựng đường cong chuẩn: Lấy chính xác 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; và 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước cho tới 6 ml ở mỗi bình rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, lại để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm (Phụ lục 4.1). Vẽ đường cong chuẩn, lấy độ hấp thụ là trục tung, nồng độ là trục hoành.

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g bột dược liệu thô đã sấy khô ở 60oC trong 6 giờ cho vào bình Soxhlet. Thêm 120 ml ether (TT), chiết tới khi dịch chiết không màu. Để nguội và gạn bỏ ether. Thêm 90 ml methanol (TT) và chiết tới khi dịch chiết không còn màu. Chuyển dịch chiết vào một bình định mức 100 ml, rửa bình chiết bằng một lượng nhỏ methanol rồi cho tiếp vào bình định mức. Thêm methanol cho tới vạch và lắc kỹ. Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước tới vạch và trộn kỹ. Lấy chính xác 3 ml cho vào bình định mức 25 ml, thêm 3 ml nước rồi thêm 1 ml dung dịch natri nitrit 5% (TT), trộn kỹ. Để yên 6 phút, thêm 1 ml dung dịch nhôm nitrat 10% (TT), trộn kỹ, để yên 6 phút. Thêm 10 ml dung dịch natri hydroxyd 10% (TT), thêm nước tới vạch, trộn kỹ và để yên trong 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm (Phụ lục 4.1). Tính khối lượng rutin (mg) của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường cong chuẩn và tính hàm lượng phần trăm rutin trong dược liệu.

Hàm lượng rutin trong nụ hoa Hoè không ít hơn 20%.

Chế biến

Khi trời khô ráo (thường vào buổi sáng), ngắt các chùm hoa chưa nở, tuốt lấy nụ, loại bỏ các bộ phận khác của cây, phơi nắng hoặc sấy nhẹ cho đến khô.

Bảo quản

Để nơi khô, tránh mốc, mọt.

Tính vị, qui kinh

Khổ, hơi hàn .Vào  các kinh can, đại tràng

Công năng, chủ trị

Lương huyết chỉ huyết, thanh can tả hoả. Chủ trị: Các chứng chảy máu, chảy máu cam, ho ra máu, băng huyết, đại tiểu tiện ra máu, đau đầu, chóng mặt, mắt đỏ, dễ cáu gắt.

Cách dùng, liều lượng

Ngày 6 – 12 g, dạng thuốc sắc.

BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘINGUYỄN THỊ HOÀIXÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH,ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC HỊE GIÁCKHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨHÀ NỘI – 2021 BỘ Y TẾTRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘINGUYỄN THỊ HOÀIMã sinh viên: 1601289XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH,ĐỊNH LƯỢNG CAO ĐẶC HỊE GIÁCKHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨNgười hướng dẫn:PGS. TS. Bùi Hồng CườngNơi thực hiện:Bộ môn Dược học cổ truyềnHÀ NỘI – 2021 LỜI CẢM ƠNTrong q trình thực hiện và hồn thành khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡquý báu của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong lĩnh vực nghiên cứu cùng bạn bè vàgia đình.Trước hết, em xin cảm hơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học cùng tồn thểcác thầy cơ giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã ln tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ vàchỉ bảo cho em trong suốt năm năm học qua.Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Bùi Hồng Cường, người đã tậntình hướng dẫn, luôn quan tâm, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trongsuốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này.Em xin chân thành cảm ơn DS. Vũ Thị Hiền – học viên cao học khóa 24, TrườngĐại học Dược Hà Nội, đã chia sẻ, giúp đỡ và hướng dẫn em tận tình trong thời gian emthực hiện khóa luận.Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển cùng các thầy cô bộmôn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình làm thựcnghiệm.Cuối cùng là lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân và bạnbè đã ln bên cạnh, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập.Hà Nội, ngày 07 tháng 06 năm 2021Sinh viênNguyễn Thị Hoài MỤC LỤCDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNGDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊĐẶT VẤN ĐỀCHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 21.1. Vị thuốc Hịe giác .............................................................................................. 21.1.1.Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây Hòe ................................. 21.1.2.Bộ phận dùng ........................................................................................... 21.1.3.Thành phần hóa học ................................................................................ 31.1.4.Tác dụng và cơng dụng theo y học cổ truyền .......................................... 61.1.5.Tác dụng sinh học của Hòe giác và sophoricosid ................................... 71.2. Tổng quan về các phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài nghiên cứu .......... 81.2.1.Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ...................................................... 81.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................... 91.3. Định tính, định lượng dược liệu Hịe giác ....................................................... 101.3.1.Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng Kông ......................................... 101.3.2.Dược điển Trung Quốc 2015 ................................................................. 14CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 152.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ............................................................................... 152.1.1.Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 152.1.2.Thiết bị, máy móc ................................................................................... 152.1.3.Hóa chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn ................................................. 152.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 162.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 162.3.1.Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hòe giác bằng TLC ............. 16 2.3.2.Xây dựng phương pháp định tính và định lượng cao đặc Hòe giác bằngHPLC............................................................................................................... 17CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................................... 223.1. Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hòe giác bằng TLC ........................ 223.1.1.Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 223.1.2.Điều kiện sắc ký ..................................................................................... 223.1.3.Kết quả định tính cao đặc Hòe giác bằng TLC ..................................... 233.2. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giác bằng HPLC 253.2.1.Khảo sát dung môi chiết ........................................................................ 253.2.2.Vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................................ 263.2.3.Thẩm định phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giác bằngHPLC............................................................................................................... 293.2.4.Định tính và định lượng cao đặc Hịe giác bằng HPLC ....................... 36CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 394.1. Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác bằng TLC ........................ 394.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng cao đặc Hịe giác bằngHPLC ......................................................................................................................... 394.3. Định tính và định lượng sophoricosid trong một số mẫu cao đặc Hòe giác .... 43KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 44TÀI LIỆU THAM KHẢOPHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTACNAcetonitrilC-HGCao đặc Hòe giácDĐTQDược điển Trung QuốcDĐVNDược điển Việt NamDLDược liệuDL-CDược liệu Hịe giác chuẩnDL-HGDược liệu Hịe giác ngun liệuĐLĐịnh lượngĐTĐịnh tínhEtOHEthanolHGHịe giácHPLCSắc ký lỏng hiệu năng caoHPTLCSắc ký lớp mỏng hiệu năng caoMeOHMethanolODSOctadecylsilane bonded silica gelRRTThời gian lưu tương đốiRTThời gian lưuSKĐSắc ký đồSOPSophoricosidTLCSắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 1.1. Các isoflavonoid phân lập được từ quả cây Hòe ............................................4Bảng 1.2. Các flavonoid phân lập được từ quả cây Hòe.................................................5Bảng 1.3. Giá trị RRT và khoảng chấp nhận của pic đặc trưng ...................................12Bảng 1.4. Chương trình dung mơi pha động .................................................................13dsasBảng 3.1. Kết quả sắc ký lớp mỏng định tính cao đặc Hịe giác ở bước sóng 254 nm 24Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết cao ............................................................ 25Bảng 3.3. Thời gian lưu (RT) và thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic chính 3SKĐ ............................................................................................................................... 28Bảng 3.4. Giá trị RRT của các pic đặc trưng ................................................................ 29Bảng 3.5. Tính thích hợp hệ thống ................................................................................ 30Bảng 3.6. Cách pha, nồng độ và kết quả các mẫu chuẩn A-F ...................................... 33Bảng 3.7. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian .............................................. 35Bảng 3.8. Kết quả chỉ tiêu độ đúng ............................................................................... 36Bảng 3.9. Thời gian lưu (phút) của các pic đặc trưng trong các SKĐ .......................... 37Bảng 3.10. Thời gian lưu tương đối (RRT) của các pic chính trong các SKĐ ............. 37Bảng 3.11. Kết quả định lượng các mẫu cao đặc Hòe giác .......................................... 38Bảng 3.12. Một số điểm mới trong phương pháp ĐT, ĐL cao đặc Hòe giác bằngHPLC ............................................................................................................................. 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊHình 1.1. Sophoricosid (SOP) ........................................................................................ 3Hình 1.2. Vân tay sắc ký đối chiếu của Hịe giác ......................................................... 12.Hình 3.1. Sắc ký đồ định tính cao đặc Hịe giác ở bước sóng 254 nm ......................... 24Hình 3.2. Sắc ký đồ mẫu chuẩn SOP ............................................................................ 26Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hịe giác chuẩn ..................................................... 26Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hịe giác ngun liệu............................................ 27Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu cao đặc Hịe giác .................................................................. 27Hình 3.6. Vân tay sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................................... 29Hình 3.7. Sắc ký đồ thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.............................. 30Hình 3.8. Sắc ký đồ mẫu cao đặc Hịe giác .................................................................. 31Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn SOP ............................................................................ 31Hình 3.10. Sắc ký đồ các mẫu nghiên cứu.................................................................... 32Hình 3.11. Phổ hấp thụ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn SOP ...................................... 32Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic ................ 34 ĐẶT VẤN ĐỀHịe giác là quả chín của cây Hịe (Sophora japonica L.), được thu hái vào mùađông, loại bỏ tạp và phơi khơ. Vị thuốc Hịe giác đã được sử dụng trong y học cổ truyềnvới công năng thanh nhiệt giảng hỏa, lương huyết chỉ huyết, chủ trị nhiệt đường ruộtgây đại tiện ra huyết, trĩ xuất huyết, can nhiệt gây đau đầu, chóng mặt, mắt đỏ [13]. Cácnghiên cứu khoa học đã chỉ ra các tác dụng của Hịe giác và sophoricosid – thành phầnhoạt chất chính trong Hòe giác, bao gồm tác dụng chống viêm, dị ứng [20], [24], tăngtạo xương, giảm mất xương, cải thiện triệu chứng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh [32],[27] và tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan [28].Phương pháp sắc là phương pháp dân gian được áp dụng từ lâu để sử dụng nhiềuvị dược liệu, trong đó có Hòe giác, tuy nhiên phương pháp này tốn thời gian và nhiềugây bất tiện khi sử dụng. Cao đặc được bào chế từ vị thuốc Hòe giác là bán thành phẩmcó thể sử dụng để tiếp tục bào chế thành các thành phẩm như viên nén, viên nang, cốm,...tiện dùng hơn. Tuy nhiên, chưa có tài liệu nào quy định tiêu chuẩn chất lượng của caođặc Hịe giác. Vì vậy, việc khảo sát một số chỉ tiêu chất lượng của cao có ý nghĩa quantrọng trong cơng tác kiểm tra chất lượng, làm tiền đề để xây dựng tiêu chuẩn của caođặc Hòe giác và các chế phẩm.Từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng caođặc Hòe giác” được nghiên cứu với các mục tiêu sau:1. Khảo sát và xây dựng phương pháp định tính cao đặc Hịe giác bằng phươngpháp sắc ký lớp mỏng.2. Khảo sát và xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hịe giácbằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN1.1.Vị thuốc Hịe giác1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của cây HịeVị trí phân loại: Cây Hịe có tên khoa học là Styphnolobium japonicum (L.) Schotthoặc Sophora japonica (L.). Cây Hòe được phân loại thực vật học như sau [2], [33]:Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)Bộ Đậu (Fabales)Họ Đậu (Fabaceae)Phân họ Đậu (Faboideae = Papilionoideae)Chi SophoraLoài Sophora japonica L.Đặc điểm thực vật: Cây gỗ, to, cao có thể đến 15 m, thân thẳng có chỏm lá trịn,vỏ hơi nứt nẻ, màu nâu sẫm. Cành nằm ngang, hình trụ, nhẵn, cong queo, màu lục nhạtvà có những chấm trắng. Lá kép lơng chim lẻ, mọc so le, có 9 – 13 lá chét mọc đối, hìnhtrứng, đỉnh nhọn, gốc tròn, nguyên, dài 3 cm rộng 1,5 – 2,5 cm, màu lục nhạt, nhất là ởmặt dưới, hơi có lơng, có lá kèm. Cụm hoa hình chùy ở đầu cành, dài 20 cm, phân nhánhnhiều. Hoa lưỡng tính, khơng đều, nhỏ, màu trắng hoặc vàng nhạt. Đài hình chng, gầnnhư nhẵn Tràng hoa hình bướm màu trắng ngà. Quả loại đậu, khơng mở, hình tràng hạt,nhẵn, dày và thắt nhỏ lại không đều ở giữa các hạt. Hạt 2 – 5, hình bầu dục, hơi dẹt, màuđen bóng [2], [3], [6], [7], [16].Ở nước ta, Hòe được trồng ở một số tỉnh miền bắc, nhiều nhất ở Thái Bình. Ở cácnước khác như Trung Quốc, Triều Tiên, Hàn Quốc, Nhật Bản cũng có trồng. Ở một sốnước châu Âu, cây Hòe chỉ được trồng làm cảnh [3], [16].Cây Hòe ra hoa vào khoảng tháng 5 đến tháng 8, quả chín từ tháng 9 đến tháng 11[6].1.1.2. Bộ phận dùngTrong y học cổ truyền, nhiều bộ phận của cây Hòe được sử dụng làm thuốc. Dượcliệu là nụ hoa được gọi là ‘Hòe mễ’, hoa đã nở được gọi là ‘Hòe hoa’ và quả Hịe chínđược gọi là ‘Hịe giác’ [3]. Ngồi ra, rễ, cành non, lá và vỏ cây Hịe cũng được sử dụnglàm thuốc với một số công dụng nhất định [16].2 Hịe giác (Fructus Sophorae) là quả chín của cây Sophora japonica L. (Fam.Leguminosae), được thu hái vào mùa đông, loại bỏ tạp chất và phơi khơ [13]. Hịe giáccó chiều dài 1 – 8 cm, đường kính 6 – 10 mm, bên ngoài màu vàng lục đến nâu vàng,nhăn nheo và thơ ráp. Mặt bên có đường khớp màu vàng. Kết cấu mềm, nhăn sau khikhô, dễ bẻ gãy ở chỗ thắt. Hạt hình trứng, dài 6 – 11 mm, bề mặt nhẵn, màu đen đến nâuđen, rốn hạt tròn ở mặt lõm, màu trắng xám. Hạt có kết cấu cứng, hai lá mầm màu vàngđến lục. Vỏ quả giữa mỏng, có vị đắng. Hạt có vị giống đậu khi nhai [13], [14].1.1.3. Thành phần hóa họcHiện nay, các nghiên cứu hóa học về S. japonica đã phân lập và xác định được hơn70 hợp chất có trong quả cây Hịe. Thành phần chính là isoflavonoid và flavonoid [16].a. IsoflavonoidIsoflavonoid là thành phần chính trong Hịe giác với gần 30 hợp chất đã phân lậpđược [16], trong đó thành phần có hàm lượng lớn nhất trong dược liệu là sophoricosid(Hình 1.1) [12]. Một số isoflavonoid khác: sophorabiosid, genistein, genistin và các dẫnchất khác của genistein,... [16] được liệt kê trong Bảng 1.1.Hình 1.1. Sophoricosid (SOP)Tên IUPAC: 5,7 – dihydroxy – 3 – [4 – [(2S, 3R, 4S, 5S, 6R) – 3,4,5 –trihydroxy – 6 – (hydroxymethyl)oxan – 2 – yl] oxyphenyl]chromen – 4 – on. [43]Công thức phân tử: C21H20O10, trọng lượng phân tử: 432,4 g/mol [43].Sophoricosid (SOP) là thành phần hoạt chất chính có trong Hịe giác, hàm lượngkhoảng 10,2% [12]. Với nhiều tác dụng dược lý nổi bật cũng như chiếm hàm lượng lớntrong quả cây Hòe, sophoricosid được ghi chép trong Dược điển Trung Quốc 2015 nhưlà tiêu chuẩn để đánh giá và kiểm tra chất lượng Hịe giác và các chế phẩm của nó. Hàm3 lượng sophoricosid quy định trong chuyên luận Hòe giác, phân tích bằng phương phápHPLC khơng được ít hơn 4,0% tính theo dược liệu khô [13].Bảng 1.1. Các isoflavonoid phân lập được từ quả cây HòeTên isoflavonoid được phân lậpSTTNăm TLTKCác isoflavon1Sophoricosid (Genistein-4′-glycosid)2Sophorabiosid3Genistein4Genistein 7-O-β-D-cellobiosid1982[17]1984[18]2001[34]2001[34]2003[41]2004[22]15 Genistein-4’-β-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-D-glucopyranosid2007[31]16 Sophorobiosid (Genisteine-4′-diglycosid)2001[39]17 Prunetin 4’-O- β-D-glucopyranosid2001[34]2002[37]5Genistein 7-O-β-D-glucopyranosid-4’-O-β-D-glucopyranosidrhamnopyranosid6Genistin (Genistein 7-glucosid)7Genistein 7-O-β-D-glucopyranosid-4’-O-β-D-glucopyranosid891011Genistein 7-O-β-D-glucopyranosid-4’-O-[(β-D-glucopyranosyl) –(1→2)-β-D-glucopyranosid]Genistein 7-O-α-L-rhamnopyranosid-4’-O-[(β-D-glucopyranosyl)(1→2)-β-D-glucopyranosid]Genistein 7-O-α-L-rhamnopyranosid-4-O-[(α-Lrhamnopyranosyl)-(1→2)-β-D-glucopyranosid]Genistein 7-O-β-D-glucopyranosid-4’-O-[(α-L-rhamnopyranosyl)(1→2)-β-D-glucopyranosid12 Genistein-7,4’-di-O-β-D-glucopyranosid13 Genistein-4’-O-L-rhamnopyranosid14 Genistein-4’-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosid18 Formononetin19 Prunetin20 Daidzein21 Di- O -methyldaidzein4 22 7,3’-di-O-methylorobol23 Pseudobaptigenin24 7-O-methylpseudobaptigenin25 Tectoridin26 Sissotrin (Biochanin A 7-O-β-D- glucopyranosid)2003[41]2020[42]2002[37]27 Orobosid28 Cajanin29 PratenseinCoumaronochromon30 Sophorophenolonb. FlavonoidTrong quả cây Hòe còn chứa một số flavonoid được liệt kê trong Bảng 1.2.Bảng 1.2. Các flavonoid phân lập được từ quả cây HòeSTTFlavonoid1Kaempferol2Sophoroflavonolosid3Kaempferol 3,7-diglucosid4Kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→6)-β-Dglucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosid5Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid6Kaempferol 3-O-α-rhamnopyranosyl(1→6)- β-glucopyranosid7Kaempferol 7-O-α-L-rhamnopyranosid8Kaempferol 3-O-(2′-O-β-D-glucosy1)-β- D-rutinosid910Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosidNăm TLTK1982[17]1983[10]1984[18]2001[34][34]2001[40]2001 [35]7-O-α-L- rhamnopyranosid;Kaempferol 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl- (1→6)]-[β-Dglucopyranosyl-(1→2)]-β-D- glucopyranosid;2002[36]2003[41]Kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6)-β-D11 glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosid-7-O-α-Lrhamnopyranosid5 12Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-2004[22]2009[26]17 Rutin1982[17]18 Quercetin1984[25]19 Isoquercitrin (Quercetin 3-O-β-D-glucopyranosid)2001[34]20 Quercetin-3-O-β-L-rhamnopyranosyl-(1→6)- β-D-glucopyranosid2007[29]21 Quercitrin2008[23]22 Isoscutellarein2001[40]23 Isorhamnetin2002[37]24 Apigenin2008[23]25 Apigenin 7-O-rutinosid2019[38]1314rhamnopyranosyl-(1→6)-β- glucopyranosidKaempferol 3-O-β-xylopyranosyl(1→3)-α- rhamnopyranosyl(1→6) [β-glucopyranosyl (1→2)]-β-glucopyranosidKaempferol 3-O-β-glucopyranosyl(1-2)-β- galactopyranosid-7O-α-rhamnopyranosidKaempferol 3-O-β-glucopyranosyl(1→ 2)[α-15 rhamnopyranosyl(1→6)]-β- glucopyranosid-7-O-αrhamnopyranosid16Kaempferol 3-O-β-glucopyranosyl(1→ 2)[α-rhamnopyranosyl(1→6)]-β- galactopyranosid-7-O-α-rhamnopyranosidc. Một số hợp chất khácCác triterpenoid, alkaloid và lipid cũng được phân lập và xác định từ quả Hịe.Ngồi ra, 14 loại acid amin cũng đã được xác định từ quả cây Hòe bao gồm lysin,asparagin, arginin, serin, acid aspartic, acid glutamic, threonin, alanin, prolin,tryptophan, valin, phenylalanin, leucin và isoleucin.1.1.4. Tác dụng và cơng dụng theo y học cổ truyềnHịe giác là một vị thuốc được biết đến từ thời xa xưa, lần đầu tiên được liệt kêtrong y văn cổ điển của Trung Quốc vào 2000 năm trước, thời nhà Hán, trong cuốn“Thần Nông bản thảo”, được xếp hạng là loại thuốc cao cấp nhất thời bấy giờ [16].Tính, vị: Tính hàn, vị đắng [6], [13].Quy kinh: Can và đại trường [13].6 Công năng: Thanh nhiệt giáng hỏa, lương huyết chỉ huyết [13].Chủ trị: Đại tiện ra huyết do nhiệt đường ruột, trĩ xuất huyết, can nhiệt gây đauđầu, chóng mặt và mắt đỏ [13].Liều dùng: 6 – 9 g [13].Kiêng kỵ: Phụ nữ có thai khơng được dùng quả Hịe, vì dễ bị sảy thai [6].Một số bài thuốc sử dụng Hòe giác [6]:- Chữa sốt xuất huyết khi sốt đã lui mà còn xuất huyết nhẹ, chảy máu dưới da,trẻ đổ máu cam, chảy máu chân răng: Quả Hòe sống, mỗi ngày dùng 10 g sắc nước uống[6].- Chữa lòi dom: Quả Hòe phối hợp với Khổ sâm, lượng bằng nhau, nghiềnthành bột mịn, hịa với nước, dùng bơi ngồi [6].- Chữa trĩ nội, viêm ruột: Quả Hòe 100 g (sao kỹ đến khi có màu nâu sẫm),Kim ngân hoa 100 g, Cam thảo dây 12 g, Nghệ vàng 10 g. Tán bột, trộn đều. Ngày uống3 lần, mỗi lần 8 g vào lúc đói (kinh nghiệm của lương y Am, Kim Sơn – Ninh Bình) [6].1.1.5. Tác dụng sinh học của Hòe giác và sophoricosidNhiều nghiên cứu in vitro và in vivo về tác dụng sinh học của Hòe giác vàsophoricosid cho thấy những tiềm năng của chúng trong điều trị và hỗ trợ điều trị mộtsố bệnh lý.a. Hoạt tính chống viêm, dị ứngSophoricosid có khả năng ức chế in vitro đến 30,24% tế bào mast giải phónghistamin, các cytokin gây viêm cũng bị ức chế trên 30% [24]. Đặc biệt, sophoricosid cótác dụng ức chế đáng kể và phụ thuộc liều đối với interleukin-5 [30], interleukin-6 vàCOX-2, đều là các trung gian hóa học trong q trình viêm [21].Trong nghiên cứu in vivo trên chuột bị gây ngứa bằng histamin sau 1 giờ uốngSOP, động vật giảm gãi do ngứa. Đối với chuột bị gây viêm da dị ứng bằng 2,4dinitroclobenzen, sử dụng SOP giúp chuột giảm mức độ viêm da và giảm IgE huyếtthanh [24]. Ngoài ra, sophoricosid làm giảm đáng kể phù chân ở chuột do carageeningây ra [20].b. Tác dụng trên bệnh loãng xươngLoãng xương là một bệnh do thiếu hụt nội tiết tố gây ra, thường gặp ở phụ nữ mãnkinh. Dịch chiết nước nóng của Hịe giác và sophoricosid làm tăng mật độ xương ởxương chày và xương thắt lưng, tăng độ cứng cơ học xương của chuột đã cắt buồng7 trứng. Trong huyết thanh chuột, nồng độ acid phosphatase và deoxypyridinolin (chấtđánh dấu tiêu xương) giảm đáng kể, nồng độ ALP, osteocalcin và canxi đều tăng [9],[32].Một thử nghiệm lâm sàng mù đơi có đối chứng placebo được thực hiện trên phụnữ mãn kinh, tuổi từ 40 – 60 cho thấy dịch chiết Hòe giác giúp cải thiện hiệu quả cáctriệu chứng sau mãn kinh so với placebo sau 12 tuần sử dụng [27].c. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ ganSophoricosid được dùng trong 8 tuần liên tiếp cho chuột có chế độ ăn nhiềufructose, kết quả cho thấy trọng lượng cơ thể và trọng lượng gan đã giảm đáng kể so vớichuột không dùng sophoricosid. Hơn nữa, nồng độ cholesterol và triglycerid ở gan cũnggiảm. Nồng độ LDL-c và apolipoprotein-B trong huyết thanh giảm, đồng thời nồng độHLD-c và apolipoprotein-A1 tăng [28].Nồng độ AST, ALT và ALP trong huyết thanh được đo, đại diện cho mức độ tổnthương gan của chuột. Sophoricosid cho thấy sự ức chế các cytokin gây viêm được giảiphóng ở gan, cùng với đó là nồng độ ALP, AST và ALT trong huyết tương giảm tăngkhi chuột dùng sophoricosid. Hình ảnh gan nhiễm mỡ cũng giảm ở nhóm dùngsophoricosid so với nhóm khơng dùng [28].Sử dụng fructose cho chuột gây ra stress oxy hóa, làm peroxy hóa lipid, sản xuấtcác cytokin viêm dẫn đến tổn thương gan. Sophoricosid tăng cường hệ thống bảo vệchống oxy hóa in vivo góp phần ngăn chặn stress oxy hóa do fructose gây ra [28].1.2.Tổng quan về các phương pháp hóa lý sử dụng trong đề tài nghiên cứu1.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)a. Nguyên tắcSắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động dichuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh là chất hấpphụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồngnhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại. Pha động là một hệ dungmôi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng trườnghợp. Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đượcdi chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quảthu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng [5].8 Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyểnRf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyểncủa dung mơi [5]:Rf =abTrong đó:a là khoảng cách di chuyển của chất phân tích;b là khoảng cách di chuyển của dung mơi tính từ điểm chấm mẫu;Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1.b. Ứng dụngPhương pháp sắc ký lớp mỏng được dùng để định tính, thử tinh khiết và đơi khi đểbán định lượng hoặc định lượng hoạt chất [5].- Định tính: Dựa vào trị số Rf và màu sắc của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy trongcùng điều kiện sắc ký.- Thử tinh khiết: Mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở việc có hay khơngcác vết lạ trên sắc ký đồ.- Định lượng: Có hai cách là tách chất phân tích trong vết sắc ký rồi định lượnghoặc đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký [1], [8].1.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)a. Nguyên tắcHPLC là kỹ thuật phân tách, trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứacác hạt pha tĩnh. Chủ yếu sự phân tách các chất dựa trên cơ chế phân bố, hấp phụ, traođổi ion, loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hóa học lập thể. Tốc độ di chuyển khácnhau liên quan đến hệ số phân bố của các chất trong hỗn hợp cần phân tích với hai phalà ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Để rửa giải các chất phântích với thời gian hợp lý, thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột cầnđược điều chỉnh cho phù hợp [5] [8].b. Các đại lượng đặc trưngThời gian lưu (tR) là thời gian cần thiết để rửa giải một chất, từ lúc tiêm mẫu vàocột đến khi pic đến detector [1], [5].Diện tích pic là đại lượng dùng để định lượng các chất [15].9 Số đĩa lý thuyết (N): Số đĩa lý thuyết biểu thị hiệu năng của cột (hay hiệu lực biểukiến của cột), được tính theo cơng thức [5], [4], [8].N = 5,54 ×(2tRW1/2t) hoặc N = 16 ×( R)2WTrong đó:W là chiều rộng đo ở đáy pic.W1/2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao của pic.c. Ứng dụngHPLC được ứng dụng nhiều trong kiểm nghiệm, dùng để định tính, định lượng,xác định giới hạn tạp chất.- Định tính: Thơng qua thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn trên sắc ký đồ.- Định lượng: Các phép định lượng bằng HPLC dựa trên nguyên tắc nồng độcủa chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Các phương pháp địnhlượng thường được sử dụng trong HPLC là phương pháp chuẩn ngoại, chuẩn nội, thêmchuẩn, thêm đường chuẩn và chuẩn hóa diện tích [4].- Xác định giới hạn tạp chất [1], [8].1.3.Định tính, định lượng dược liệu Hịe giácDược điển Việt Nam V hiện chưa có chuyên luận Hòe giác.Trong cuốn Hong Kong Chinese Materia Medica Standards (Tiêu chuẩn dược liệulàm thuốc Hồng Kông) [14] và Dược điển Trung Quốc 2015 [13], chun luận Hịe giáccó quy định về chỉ tiêu định tính và định lượng Hòe giác bằng phương pháp HPLC vàTLC.1.3.1. Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc Hồng KơngĐịnh tính dược liệu Hịe giác1.3.1.1.a. Định tính bằng TLCChuẩn bị mẫu:- Dung dịch thử: Cân 0,1 g bột dược liệu vào bình nón 50 ml, thêm 10 mlethanol 70%. Siêu âm hỗn hợp trong 30 phút (160 W). Lọc lấy dịch.- Dung dịch chuẩn: Cân 1,0 mg SOP và hòa tan trong 2 ml ethanol 70%.Điều kiện sắc ký:-Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254.-Pha động: Ethyl acetat – ethanol – acid acetic (7,5 : 1 : 0,5).10 Tiến hành: Sử dụng hệ thống HPTLC. Chấm lên bản mỏng 3 µl dung dịch chuẩnvà 3 µl dung dịch thử. Triển khai sắc ký khoảng 5 cm. Để khô và quan sát bản mỏng ởánh áng UV 254 nm. Tính tốn giá trị Rf sử dụng cơng thức ở mục 1.3.1.Yêu cầu: Mẫu thử phải cho vết hoặc dải trên sắc ký đồ có các đặc tính về màu sắcvà giá trị Rf tương ứng với vết hoặc dải của mẫu chuẩn SOP. [14]b. Định tính bằng sắc ký lỏng hiệu năng caoChuẩn bị mẫu:- Dung dịch thử: Chuẩn bị như dung dịch thử ở phần định lượng 1.3.1.1.- Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác 0,4 mg sophoricosid và hòa tan trong 20 mlethanol 70%.Điều kiện sắc ký: Như ở phần định lượng 1.3.1.1.Yêu cầu độ thích hợp hệ thống:- Thực hiện tiêm lặp lại ít nhất 5 lần, mỗi lần 10 µl dung dịch SOP chuẩn, các yêucầu về độ thích hợp hệ thống như sau:o RSD của diện tích pic SOP khơng q 5,0%.o RSD của thời gian lưu của pic SOP không quá 2,0%.o Hiệu lực cột: Khơng ít hơn 30.000 đĩa lý thuyết theo pic SOP.Tiến hành sắc ký: Tiêm 10 µl lần lượt dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệthống HPLC và ghi nhận sắc ký đồ. Ghi nhận thời gian lưu của pic SOP trong sắc ký đồcủa SOP chuẩn và thời gian lưu của 5 pic đặc trưng trên sắc ký đồ của dung dịch thử(Hình 1.2). Nhận dạng pic SOP trên sắc ký đồ của dung dịch thử bằng cách so sánh thờigian lưu với pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn SOP. Thời gian lưu của pic SOP từ haisắc ký đồ không khác biệt quá 2,0%. Tính tốn thời gian lưu tương đối (RRT) của cácpic đặc trưng theo thời gian lưu (RT) theo công thức:RRT =RT picRT pic SOPTrong đó:RTpic là thời gian lưu của pic đang tính RRT (phút)RTpic SOP là thời gian lưu của pic SOP trên sắc ký đồ đó (phút)11 Hình 1.2. Vân tay sắc ký đối chiếu của Hịe giácCác giá trị thời gian lưu tương đối và khoảng chấp nhận của 5 pic đặc trưng củaHòe giác được liệt kê ở Bảng 1.4.Bảng 1.3. Giá trị RRT và khoảng chấp nhận của pic đặc trưngSTT picRRTKhoảng chấp nhận10,62± 0,0320,70± 0,033 (rutin)0,81± 0,034 (marker, sophoricosid)1,00-51,07± 0,03Yêu cầu: Mẫu thử phải cho 5 pic đặc trưng ở trên với thời gian lưu tương đối nằmtrong khoảng chấp nhận của pic tương ứng trên vân tay sắc ký đối chiếu (Hình 1.2).[14]1.3.1.2. Định lượng bằng phương pháp HPLCChuyên luận Hòe giác trong quyển V, cuốn “Tiêu chuẩn dược liệu làm thuốc HồngKông” quy định chỉ tiêu định lượng sophoricosid trong dược liệu Hòe giác [14]: Chuẩn bị mẫu:- Dung dịch chuẩn gốc sophoricosid (100 mg/L): Cân chính xác 1,0 mg SOP chuẩnvà hòa tan trong 10 ml ethanol 70%.12 - Dung dịch chuẩn sophoricosid: Lấy chính xác một thể tích dung dịch chuẩn gốc,pha lỗng với ethanol 70% để được dãy dung dịch chuẩn SOP có nồng độ 0,5 mg/L, 10mg/L, 20 mg/L, 30 mg/L, 40 mg/L.- Dung dịch thử: Cân chính xác 0,2 g bột dược liệu và cho vào ống ly tâm 50 ml,thêm 25 ml ethanol 70%. Siêu âm trong 30 phút (160 W). Ly tâm 5 phút với tốc độ 5000vòng/phút. Lọc và chuyển dịch lọc vào bình định mức 50 ml. Thêm 25 ml ethanol 70%vào phần cắn và lặp lại các bước siêu âm, ly tâm, lọc một lần nữa. Gộp dịch lọc và thêmethanol 70% đến vạch. Lấy chính xác 1 ml dung dịch cho vào bình định mức 10 ml vàthêm ethanol 70% đến vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 µm thu được dung dịch tiêm sắcký. Điều kiện sắc ký:- Pha tĩnh: Silica gel C18 (ODS).- Pha động: Methanol – acetonitril – acid formic 0,4%. Chương trình dung mơi:Bảng 1.4. Chương trình dung mơi pha độngThời gian (phút)Acid formic 0,4%0 – 60Acetonitril ̶ Methanol(%, v/v)85 → 70(50 : 50, v/v)(%, v/v)15 → 30- Tốc độ dòng pha động: 1 ml/phút- Detector: DAD ở 260 nm. Yêu cầu độ thích hợp hệ thống:- Thực hiện tiêm lặp lại ít nhất 5 lần, mỗi lần 10 µl dung dịch sophoricosid chuẩncó nồng độ 20 mg/L. Các yêu cầu về độ thích hợp hệ thống như sau:o RSD của diện tích pic SOP không quá 5,0%.o RSD của thời gian lưu của pic SOP khơng q 2,0%.o Hiệu lực cột: Khơng ít hơn 30.000 đĩa lý thuyết tính theo pic SOP. Đường chuẩn: Tiêm một dãy chuẩn SOP, mỗi dung dịch 10 µl vào hệ thống HPLCvà ghi nhận sắc ký đồ. Xây dựng đường chuẩn giữa diện tích pic SOP và nồng độ tươngứng của SOP. Lấy hệ số góc, hệ số chắn và hệ số tương quan R2 từ đường chuẩn 5 điểm. Tiến hành sắc ký: Tiêm 10 µl dung dịch thử vào hệ thống HPLC và ghi nhận sắc kýđồ. Nhận dạng pic SOP trên sắc ký đồ của dung dịch thử bằng cách so sánh thời gianlưu với pic trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn SOP. Thời gian lưu của pic SOP từ hai sắc13 ký đồ khơng khác biệt q 5,0%. Từ diện tích pic, tính nồng độ SOP trong dung dịchthử nhờ sử dụng đường chuẩn. Yêu cầu: Mẫu thử chứa ≥ 4,0% sophoricosid (C21H20O10), tính theo dược liệu khơ.[14]1.3.2. Dược điển Trung Quốc 20151.3.2.1.Định lượng bằng phương pháp HPLCChuẩn bị mẫu:- Dung dịch thử: Cân chính xác 2 g bột dược liệu (qua rây số 3) vào bình nóncó nút mài, thêm chính xác 50 ml ethanol 70% và siêu âm (300 W, 25 kHz) trong 45phút, làm mát, cân lại và bổ sung lượng ethanol 70% đã mất và lắc đều. Lọc và lấy chínhxác 0,5 ml dịch lọc vào bình định mức 20 ml. Thêm methanol đến vạch, lắc đều thuđược dịch tiêm sắc ký.- Dung dịch đối chiếu: Cân chính xác một lượng SOP chuẩn, hịa tan vàomethanol được dung dịch chứa 40 µg/ml làm dung dịch đối chiếu.Điều kiện sắc ký:- Pha tĩnh: Silica gel C18 (ODS).- Pha động: Methanol – acetonitril – acid phosphoric 0,07% (12 : 20 : 68).- Detector: Máy quang phổ ở 260 nm.- Số đĩa lý thuyết được tính theo pic của SOP khơng ít hơn 3.000.Tiến hành sắc ký: Tiêm chính xác lần lượt 10 µl dung dịch đối chiếu và dung dịchthử vào cột và tính hàm lượng SOP.u cầu: Khơng ít hơn 4,0% sophoricosid (C21H20O10) tính theo dược liệu khô.[13]1.3.2.2.Định tính bằng phương pháp HPLCChuẩn bị mẫu thử, mẫu chuẩn, tiến hành sắc ký với điều kiện sắc ký như phần địnhlượng (1.5.1.1.), ghi lại thời gian lưu của pic SOP của mẫu đối chiếu và so sánh với thờigian lưu các pic thu được trên sắc ký đồ mẫu thử.Yêu cầu: Thời gian lưu của pic thu được trên sắc ký đồ mẫu thử phải tương ứngvới thời gian lưu của pic trên sắc ký đồ mẫu đối chiếu. [13]14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị2.1.1. Đối tượng nghiên cứuDược liệu Hòe giác đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc 2015 [13].Cao đặc Hòe giác được bào chế từ dược liệu Hịe giác nghiền thành bột, rây quarây có kích thước lỗ rây 2 mm. Bột dược liệu được ngâm trong hỗn hợp dung môi ethanol– nước trong 60 phút, tỷ lệ dung môi/dược liệu là 8 ml/g, sắc 2 lần, mỗi lần 60 phút, côthành cao đặc.2.1.2. Thiết bị, máy móc-Tủ sấy Memmert (Đức).-Bể siêu âm T840DH – Elma (Đức).-Cân kỹ thuật Precisa (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 g.-Cân phân tích AND GR200 (Nhật Bản) độ chính xác 0,1 mg.-Cân phân tích Mettler Toledo XPE105 (Thụy Sĩ) độ chính xác 0,01 mg.-Máy đo độ ẩm Precisa XM120.-Hệ thống lọc chân khơng, màng lọc 0,45 µm.-Hệ thống thiết bị sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Linomat 5 (CamagSwitzerland).-Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu bao gồm: Bơm LC-30AD, detectormảng diod (DAD) SPD-M20A, bộ phận ổn nhiệt CTO-10AS của Shimadzu, hệthống tiêm mẫu tự động SIL-20A.-Các dụng cụ thủy tinh: Bình gạn, bình nón, bình định mức, cốc có mỏ,… và cácdụng cụ khác tại phịng thí nghiệm đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích.-Bộ nồi chiết, cô cao inox, bếp cách thủy, các dụng cụ chế biến thuốc.2.1.3. Hóa chất, chất chuẩn, dược liệu chuẩn-Dược liệu Hòe giác chuẩn (Xinyang Zhongjian Metrology BiologicalTechnology Co., Ltd., Lot No. 180305) đạt tiêu chuẩn Dược điển Trung Quốc2015 [13].-Chất chuẩn sophoricosid (C21H20O10) hàm lượng 99,34% (Xinyang ZhongjianMetrology Biological Technology Co., Ltd., Lot No. 200419).-Bản sắc ký lớp mỏng Silica gel 60 F254 của Merck.15 -Hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích, được mua tại Công ty Trách nhiệm hữu hạnSela, 48 Thọ Lão, phường Đống Mác, quận Hai Bà Trưng, Hà Nội: Methanol,ethanol tuyệt đối, ethyl acetat, n-butanol, acid formic, acetonitrile (Merck),methanol (Merck), toluen,…2.2. Nội dung nghiên cứu2.2.1. Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hòe giác bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)Khảo sát điều kiện sắc ký.Định tính cao đặc Hịe giác bằng TLC.2.2.2. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng cao đặc Hòe giác bằng sắc kýlỏng hiệu năng cao (HPLC)Khảo sát điều kiện sắc ký.Thẩm định phương pháp phân tích.Định tính, định lượng một số mẫu cao đặc Hịe giác bằng HPLC.2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Khảo sát phương pháp định tính cao đặc Hịe giác bằng TLCMẫu nghiên cứu:- Dược liệu chuẩn Hòe giác được nghiền thành bột thơ.- Dược liệu ngun liệu Hịe giác được nghiền thành bột thơ.- Cao đặc Hịe giác.- Chất chuẩn sophoricosid.Chuẩn bị mẫu:- Cao đặc Hòe giác: Cân 0,50 g cao đặc vào bình nón có nút mài 100 ml, thêm10 ml methanol 50%, chiết siêu âm 30 phút, lọc. Cô dịch lọc trên bếp cách thủy đến cắn.Hòa tan cắn trong 2 ml methanol 50% được dung dịch thử phun sắc ký.- Dược liệu Hòe giác nguyên liệu và dược liệu Hịe giác chuẩn: Cân 0,50 g bộtthơ mỗi loại. Tiến hành chiết như mơ tả ở phần cao đặc Hịe giác được dung dịch Hòegiác nguyên liệu và dung dịch Hịe giác chuẩn.- Chất chuẩn SOP: Cân chính xác khoảng 2,00 mg chuẩn SOP (99,34%) chovào bình định mức 10 ml, thêm 8 ml methanol 50%, siêu âm đến khi tan hoàn toàn, thêmmethanol 50% đến vạch thu được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 200 µg/ml.Tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác định các vết và Rf trong các mẫu nghiên cứuvới các điều kiện chung:16 - Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel 60 F254, hoạt hóa ở 110 ºC trong 60 phút.- Pha động: Tiến hành khảo sát các hỗn hợp pha động khác nhau.- Chấm mẫu: Thiết bị Linomat 5 (Camag). Chấm các mẫu trên băng dài 8 mm,cách cạnh dưới bản mỏng 10 mm, cách cạnh bên 15 mm, tốc độ 50 nl/s.- Triển khai:+ Dùng máy triển khai sắc ký tự động ADC2.+ Kiểm sốt độ ẩm: dung dịch KSCN bão hịa trong 10 phút.+ Bão hịa bình triển khai 260 x 10 trong 20 phút bằng 25 ml dung môi phađộng.+ Thể tích dung mơi khai triển: 10 ml.+ Khoảng cách khai triển là 70 mm kể từ vị trí chấm.+ Sấy khô bản mỏng trong 5 phút.- Hiện vết:+ Ánh sáng UV tại bước sóng 254 nm.+ Thuốc thử hiện vết: Tham khảo tài liệu và khảo sát các thuốc thử hiện vết.- Chụp ảnh sắc ký đồ: Buồng chụp Camag.- Xử lý kết quả: Phần mềm Wincats, Videoscan.So sánh các vết trên sắc ký đồ giữa cao đặc Hòe giác với dược liệu nguyên liệu,dược liệu chuẩn và chất chuẩn về số vết, vị trí, màu sắc và độ đậm nhạt.2.3.2. Xây dựng phương pháp định tính và định lượng cao đặc Hòe giác bằng HPLC2.3.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích Mẫu nghiên cứu:Cao đặc Hịe giác.Dược liệu chuẩn Hòe giác.Chất chuẩn sophoricosid. Chuẩn bị các dung dịch thử, dung dịch chuẩn:Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 2,17 mg chất chuẩn SOP (99,34%) cho vào bìnhđịnh mức 10 ml, thêm 8 ml methanol 50%, siêu âm đến khi tan hoàn toàn, thêm methanol50% đến vạch thu được dung dịch chuẩn gốc (chuẩn A) có nồng độ 215,57 µg/ml. Phadãy 5 dung dịch chuẩn SOP (B, C, D, E, F) bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốcbằng methanol 50%.17