1.2.1. Một số kỹ thuật di truyền phân tử thường dùng để chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia ở Việt Nam Bệnh huyết sắc tố (haemoglobinopathies) là một nhóm đa dạng các bệnh di truyền lặn nguyên nhân do các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng chuỗi globin của phân tử Hemoglobin (Hb). Đây là một trong những bệnh di truyền đầu tiên được mô tả ở cấp độ phân tử và do đó trở thành nguyên mẫu cho việc phát triển các kỹ thuật xác định đột biến mới. Hiện nay trên thế giới có rất nhiều kỹ thuật khác nhau dựa trên phản ứng PCR được sử dụng nhằm phát hiện các đột biến gen globin, bao gồm: dot blot analysis, reverse dot blot analysis, ARMS (the amplification refractory mutatin system), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis, gap-PCR, phân tích enzyme endonuclease hạn chế (restriction endonuclease - RE analysis), real-time PCR, Sanger sequencing, Pyrosequencing, MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) và hệ thống phân tích gen [32], [33], [34], [35]. Mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp sử dụng ở mỗi phòng xét nghiệm (labo) phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: trình độ chuyên môn và kỹ thuật hiện có của labo chẩn đoán, các dạng đột biến và tỷ lệ đột biến trong quần thể, ngoài ra còn phụ thuộc vào kinh phí hiện có tại mỗi cơ sở. Ở Việt Nam, các phương pháp thường được dùng để xác định đột biến gen globin được trình bày như ở phần dưới đây. 1.2.1.1. Kỹ thuật multiplex gap-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, nhằm phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm. Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985 và Saiki thử nghiệm thành công vào năm 1988. Gap-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách, là kỹ thuật sử dụng hai mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi và mạch ngược trong vùng DNA chứa đoạn gen bị mất. Với các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ hơn 1 kb, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, trong đó đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ allen bị mất đoạn. Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn để có thể khuyếch đại được allen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đại sản phẩm từ allen mang đột biến mất đoạn. Trong trường hợp này allen bình thường sẽ được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sử dụng một mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi khác theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA còn lại. Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản, tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãy mới thiết kế được cặp mồi tương ứng. Multiplex-PCR là phản ứng PCR đa mồi sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR. Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu. Đối với Thalassemia, người ta thường dùng kỹ thuật Multiplex gap-PCR trong chẩn đoán các mất đoạn α-thalassemia [36], [37], [38], [39], một vài mất đoạn β-thalassemia [40], [41], [42], [43], [44], [45], mất đoạn δβ-thalassemia và HPFH thalassemia [46]. Bảng 1.5. Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-PCR Thể bệnh Đột biến mất đoạn α0-thalassemia --SEA --MED -(α)20.5 --FIL --THAI α+-thalassemia -α3.7 -α4.2 β0-thalassaemia 290 bp deletion 532 bp deletion 619 bp deletion 1393 bp deletion 1605 bp deletion 3.5 kb deletion 10.3 kb deletion 45 kb deletion (δβ)0-thalassaemia Hb Lepore Spanish Sicilian Vietnamese Macedonian/Turkish HPFH HPFH1 (African) HPFH2 (Ghanaian) HPFH3 (Indian) Gap-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh các đột biến mất đoạn gây α0-thalassemia và α+-thalassemia, nhưng đòi hỏi sự ứng dụng cẩn thận đối với chẩn đoán trước sinh. Hầu hết các dạng α-thalassemia thường gặp do đột biến mất đoạn đều có thể được chẩn đoán bằng gap-PCR [47]. Hiện nay người ta đã công bố các trình tự mồi (primers) cho chẩn đoán 3 đột biến mất đoạn gây α0-thalassemia và 2 đột biến mất đoạn gây α+-thalassemia [36], [37], [38], [39], được liệt kê như trong bảng 1.4. Các đột biến mất đoạn α0-thalassemia bao gồm: đột biến dạng --SEA, thường được tìm thấy ở các cá thể người Đông Nam Á; --MED và -(α)20.5, thường gặp ở người Địa trung hải; --FIL, hay gặp ở người Philippin; và --THAI, ở người Thái. 2 đột biến mất đoạn α+-thalassemia bao gồm đột biến mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trên 1 gen α. Hiện nay, các mồi thường được thiết kế theo dạng kép hoặc đa mồi, theo đó 2 đột biến -α3.7 và -α4.2 sẽ được phát hiện qua 1 phản ứng, --MED và -(α)20.5 trong 1 phản ứng, và 3 đột biến ở người Đông Nam Á ở 1 phản ứng [47]. Hình 1.8. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+-thalassemia bằng multiplex gap-PCR (Nguồn: John Old , 2012 [47]) Hình 1.9. Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0-thalassemia bằng multiplex gap-PCR 1.2.1.2. Phương pháp ARMS-PCR Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction) được sử dụng trong xác định các đột biến điểm đã biết, lần đầu được mô tả bởi tác giả Newton và cộng sự [48]. Nó được phát triển cho việc chẩn đoán hầu hết các đột biến điểm β-thalassemia phổ biến ở các nhóm chủng tộc chính [49]. Phản ứng này dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và 1 mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen [50]. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước. Các primer ARMS đặc hiệu đột biến được sử dụng trong thư viện Oxford được dùng để chẩn đoán 25 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp trên thế giới cũng như 1 số đột biến điểm gây bệnh α-thalassemia [47]. Hình 1.10. Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR (Nguồn: Hossein N., 2001 [51]) Ở Việt Nam, Lê Thị Hảo đã ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia và xây dựng được kỹ thuật ARMS để phát hiện đột biến gen này tại thành phố Hồ Chí Minh [52]. Hiện nay, ARMS-PCR thường được dùng để sàng lọc 2 đột biến điểm HbCs, HbQs gây α-thalassemia. Còn với β-thalassemia, 9 đột biến thường gặp được chia thành 3 nhóm và được được sàng lọc đồng thời như bảng 1.5 theo nghiên cứu của Hương Lê (2000) trên quần thể người Đông nam Á [53]. Đột biến được phát hiện qua multiplex ARMS-PCR, được xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR. Riêng với đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS-PCR nếu có HbE dương tính với điện di huyết sắc tố. Bảng 1.6. Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu Bước sàng lọc Loại đột biến Mồi đặc hiệu Mồi chung Độ dài (bp) 1 CD17 (AAG - TAG) CD41/42 (-TTCT) -28 (A > G) IVS 1-1 (G > T) CD17M CD41/42M -28M IVS 1-1M Thal B 240 439 107 281 2 IVS 1-5 (G > C) CD71/72 (+A) IVS 2-654 (C > T) CD95 (+A) IVS 1-5M CD71/72M IVS 2-654M CD95M Thal B Thal C Thal F Thal B 285 241 382 163 3 CD26 (G > A) HbE-M BT-B 271 1.2.1.3. Phương pháp MLPA Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) ra đời năm 2002 và được MRC-Holland phát triển, là một bước tiến mới trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và Thalassemia nói riêng. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng MLPA là phương pháp dễ dàng, nhanh chóng, hiệu quả, kinh tế và phù hợp trong việc phát hiện các vi mất đoạn và vi lặp đoạn, thậm chí là những mất đoạn nhỏ. Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng. Thông thường, mỗi probe chứa 2 đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau. Ở Việt Nam, kỹ thuật MLPA được thực hiện bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại P140-B4 để phát hiện các đột biến mất đoạn trên gen α và β globin. Kết quả được phân tích trên phần mềm COFALYSER. 1.2.1.4. Phương pháp giải trình tự gen Giải trình tự gen là xác định thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid: A (adennine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine) trên phân tử DNA. Hiện nay, giải trình tự gen thường được thực hiện trên các máy tự động (như ABI 3130...), kết quả được phân tích bằng phần mềm đi kèm, sau đó được đưa lên ngân hàng gen (Gene Bank) để so sánh với trình tự gen globin chuẩn. Qua đó, có thể xác định các đột biến điểm chưa biết và các biến thể của bệnh. Mặc dù các phương pháp như: multiplex gap-PCR và ARMS-PCR đã giúp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia khá hiệu quả nhưng vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, đó là không phát hiện được cùng lúc nhiều đột biến, sử dụng đa mồi nên khá phức tạp, cần điện di để kiểm tra sản phẩm, sử dụng hóa chất độc hại đối với người làm xét nghiệm, thời gian lâu, trong khi yêu cầu quan trọng của chẩn đoán trước sinh là phải đơn giản, nhanh chóng và chính xác. Với phương pháp MLPA và giải trình tự gen thì chi phí lại quá đắt, không phù hợp với phần đông dân số Việt Nam. 1.2.2. Phát hiện các đột biến gây bệnh Thalassemia trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng phương pháp lai ngược (reverse hybridyzation) Kỹ thuật Reverse dot blot hybridization (Reverse hybridization) cung cấp một nền tảng cho kỹ thuật lai các đầu dò đặc hiệu cao. Các đầu dò đặc hiệu alen (allele specific oligonucleotide - ASO probes) bình thường và đột biến được gắn cố định trên các dải nitrocenllulose (nitrocenllulose strips) có màng nylon hoặc các hạt Luminex (Luminex beads), thay vì gắn trực tiếp lên mẫu DNA phân tích. Đây là một phương pháp không sử dụng phóng xạ. Trong kỹ thuật này, các đầu dò ASO đặc hiệu đột biến (mutant) và bình thường (wild type) được lai với các mẫu DNA nhằm sàng lọc nhiều đột biến cùng lúc. Phương pháp Reverse hybridization lần đầu được mô tả bởi Saiki và cộng sự [54], và sau đó được phát triển để sàng lọc các đột biến gây bệnh β- thalassemia ở người Sicilian, và được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh [55], [56]. Về lý thuyết, Reverse hybridization có thể được thiết kế để phát hiện bất cứ đột biến nào đã được xác định trong một quần thể nhất định sau khi các điều kiện đã được sắp đặt cẩn thận. Reverse hybridization đã được sử dụng để xác định các đột biến gây bệnh α-thalassemia [56], β-thalassemia cũng như xác định kiểu gen của các biến thể của gen β globin chính (HbS, HbC, HbD…) [47]. Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh dấu bằng cách sử dụng mồi có đầu 5’ sửa đổi với biotin, hoặc đánh dấu trong quá trình khuếch đại DNA (bằng biotin-16-dUTP). Các sản phẩm khuếch đại này có thể được biến tính và lai với các đầu dò cố định. Sau các bước rửa nghiêm ngặt, sản phẩm lai đặc hiệu có thể được phát hiện. Trên các thanh lai (Reverse hybridization Strips), kết quả này có thể nhìn thấy bằng mắt thường. Còn đối với Luminex beads, kết quả sẽ được đo bằng phần mềm đặc hiệu (Luminex Reader). Dựa trên kỹ thuật Reverse hybridization, hãng ViennaLab Diagnostics GmbH của Austria đã xây dựng bộ kit Globin StripAssay ứng dụng cho chẩn đoán bệnh Thalassemia, nhằm phát hiện 22 đột biến trên gen β globin - dạng phổ biến ở người Đông Nam Á (β-Globin StripAssay SEA), và 21 đột biến trên gen α globin (α-Globin StripAssay). Bộ kit này đáp ứng tiêu chuẩn ISO, tất cả các sản phẩm đều được đánh dấu CE (Conformité Européene) và IVD (In Vitro Diagnostics). Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã chứng tỏ Globin StripAssay là một phương pháp đơn giản, nhanh, hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia [51], [57], [58], [59], [60]. Hiện nay, kit Globin StripAssay đã được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới như: Áo, Iran, Singapo, Thái Lan… 1.2.2.1. Ưu điểm của phương pháp Phương pháp này đã chứng tỏ có nhiều ưu điểm so với các phương pháp thông thường: - Dễ thực hiện. - Có thể cùng lúc phát hiện được nhiều đột biến nhờ phản ứng đơn giản (với kit Globin StripAssay là trên 20 đột biến trên mỗi gen globin). - Nhanh chóng (thời gian xét nghiệm từ 6 ÷ 8 giờ). - Độ chính xác cao. - Lượng mẫu cần cho xét nghiệm ít (khoảng 10 ÷ 50ng DNA cho một phản ứng PCR duy nhất). - Không sử dụng các hóa chất độc hại. - Phương tiện máy móc đơn giản ( máy PCR, agarose gel, máy lắc …). - Phân tích kết quả đơn giản từ các thanh phản ứng (Teststrip). 1.2.2.2. Quy trình xét nghiệm Quy trình xét nghiệm gồm 3 bước: - Tách chiết DNA. - Phản ứng khuếch đại PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu. - Lai các sản phẩm khuếch đại với Teststrip có sẵn chứa các đầu dò oliginucleotide đặc hiệu alen đột biến (mutant) và alen người bình thường không có đột biến (wild type). Sau các bước rửa đặc hiệu, trình tự giới hạn được phát hiện nhờ các phản ứng màu enzym. 1.2.2.3. Các đột biến có thể được phát hiện Kit Globin StripAssay phát hiện được hơn 20 đột biến trên mỗi gen globin. - β-Globin StripAssay SEA Bảng 1.7. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA STT Loại đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia 1 -31 A > G β+ 2 -29 A > G β+ 3 -28 A > G β+ 4 cap+1 A > C β+ 5 init codon ATG > AGG β° 6 codon 8/9 + G β° 7 codon 15 TGG > TAG β° 8 codon 17 A > T β° 9 codon 19 A > G (Malay) β+ 10 codon 26 G > A (HbE) - 11 codon 27/28 + C β° 12 IVS 1.1 G > T β° 13 IVS 1.5 G > C β+ 14 codon 41/42 -TTCT β° 15 codon 43 G > T β° 16 codon 71/72 + A β° 17 codon 89/90 -GT β° 18 codon 90 G > T β° 19 codon 95 + A β° 20 IVS 2.1 G > A β° 21 IVS 2.654 C > T β+ 22 codon 121 G > T β+ - α-Globin StripAssay Bảng 1.8. Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay STT Tên đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia 1 -α3.7 Mất đoạn 1 gen 2 -α4.2 Mất đoạn 1 gen 3 -(α)20.5kb Mất đoạn 2 gen 4 --MED Mất đoạn 2 gen 5 --SEA Mất đoạn 2 gen 6 --THAI Mất đoạn 2 gen 7 --FIL Mất đoạn 2 gen 8 α1 cd 14 G > A 9 α1 cd 59 G > A Hb Adana 10 anti-3.7 Nhân 3 lần gen 11 α2 init cd T > C 12 α2 cd 19 -G 13 α2 IVS 1 -5nt 14 α2 cd 59 G > A 15 α2 cd 125 T > C Hb Quong Sze 16 α2 cd 142 T > C Hb Constant Spring 17 α2 cd 142 T > A Hb Icaria 18 α2 cd 142 A > T Hb Pakse 19 α2 cd 142 A > C Hb Koya Dora 20 α2 poly A-1 AATAAA > AATAAG 21 α2 poly A-2 AATAAA > AATGAA 1.2.2.4. Phân tích kết quả Kiểu gen của mẫu xét nghiệm được xác định bằng cách quan sát trên Teststrip. Vạch chứng nội tại (Control) phải luôn dương tính, nó chứng tỏ hoạt động đúng của các hóa chất trong bộ kit. 1.3. Các nghiên cứu chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia và kỹ thuật Reverse hybridization (StripAssay, Vienna Lab) trong xác định đột biến gen gây bệnh Thalassemia Năm 2007, tác giả Nguyễn Khắc Hân Hoan đã tiến hành chẩn đoán Thalassemia bằng phương pháp ARMS-PCR, MLPA và giải trình tự gen trên 290 trường hợp thai của các cặp vợ chồng mang đột biến gen α-thalassemia hoặc β-thalassemia, phát hiện 207 thai có đột biến (207/290; 71,4%). Trong đó, 128 thai bị đột biến α-thalassemia (128/290; 44%) cao hơn 2 lần so với số thai bị đột biến β-thalassemia (59/290; 20,3%), 20 thai (20/290; 6,9%) mang đồng thời đột biến α-thalassemia và β-thalassemia. Có 62 thai (62/290; 21,4%) có đột biến nặng gồm: Hb Bart’s (38/290; 13,1%), HbH (9/290; 3,1%), β-thalassemia nặng (15/290; 5,2%). Tỉ lệ alen đột biến α-thalassemia (67,2%) hơn gấp đôi β-thalassemia (32,8%) trong tổng số 287 alen được phát hiện. Đột biến --SEA và HbE chiếm đa số, tiếp theo là -a3.7, codon 41/42 (– TCTT), codon17 (+A) [61]. Tác giả Lý Thị Thanh Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử (Multiplex ARMS-PCR, ARMS-PCR và kỹ thuật giải trình tự gen HBB) trong chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia |
